Aimée du grand public, Guylaine Tremblay a indéniablement laissé sa trace au théâtre, au cinéma et dans le monde de l'improvisation en participant pendant sept ans à la Ligue nationale d'improvisation.

À la télévision, la première image qui nous vient en tête est sans aucun doute Caro de La petite vie. Longtemps associée à la comédie avec Le club des 100 watts, Le monde merveilleux de Ding et Dong, 4 et demi, La vie après l'amour et Histoires de filles, Guylaine brise la chaîne et accepte le rôle de Sylvie dans le téléroman Emma, ce qui lui vaut un second prix Gémeaux en 2002 pour la meilleure interprétation féminine dans un rôle de soutien.

Dans Annie et ses hommes, Guylaine interprète à merveille une femme à l'aube de la quarantaine qui a le don de toucher et de faire sourire. Elle a gagné le trophée Artis en 2004, 2005 et 2006 dans la catégorie «rôle féminin/téléromans québécois» pour ce rôle.